吴彦祖出生于1974年，父亲是电气工程师，从事计划核电站，母亲是大学生理学传授。他自己则毕业于美国俄勒冈大学修建系，并得到修建副修奖学金。1997年在姐姐的勉励下开始当模特，被《美少年之恋》导演杨凡看中，苦口婆心之下同意出演首部电影。

首部电影之后，相继与成龙、舒淇、王祖贤、杨千嬅等合作出演多部影戏，2002年后渐入佳境，多次提名香港电影金像奖，2005年因出演《新警员故事》中邪魅狂狷的反派关祖斩获第41届台湾影戏金马奖最佳男配角。